利用共价探针捕获去磷酸核糖泛素化酶

分享一篇最近发表在J Am Chem Soc上的文献，题目为“Covalent Probes To Capture Legionella pneumophila Dup Effector Enzymes”，文章的通讯作者为荷兰莱顿大学医学中心的Gerbrand J van der Heden van Noort教授，其团队的主要研究方向为蛋白翻译后修饰。

磷酸核糖泛素化（phosphoribosyl ubiquitination）是最近发现的一种新型翻译后修饰。在嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）侵染宿主后，前者的SidE效应器以独立于经典泛素化机制的模式在底物的丝氨酸残基上引入磷酸核糖泛素化修饰，促进宿主合成含军团菌的液泡。相应地，该种修饰也受到去磷酸核糖泛素化修饰酶（Dups）的调控，目前已鉴定到两种Dup酶，即DupA和B，但这些研究几乎都在重组蛋白层面进行，尚未实现在复杂细胞环境中对Dups的全局分析。本文中，作者利用巧妙设计的共价探针在受嗜肺军团菌侵染的细胞裂解物中实现了对Dups的捕获。

研究已初步阐明Dup酶通过非经典的Glu-His-His三联体断裂磷酸核糖泛素化修饰中磷酸二酯键的机理：首先，Dup的His67进攻磷酸核糖形成亚磷酸酯中间体，随后其His189进一步进攻该中间体，最终使底物脱去修饰。作者设计了一类磷酸核糖泛素化修饰蛋白的模拟物，其中，用一组共价反应性基团替代天然结构中的磷酸二酯基团——这样一来，当这种模拟物探针被体系中的Dups识别时，共价弹头即得以接近催化三联体中的His残基，从而实现对Dups的标记。技术上，作者在重组泛素上引入了生物正交把手和荧光报告基团，并通过点击化学反应与核苷-共价弹头部分相偶联，实现了探针的合成。以已知的DupA为靶标，作者初步测试了这些共价探针的反应性，证实了如此设计的模拟物保留了被DupA识别的能力。其中，带有乙烯基磺酸酯的探针5展示出了最强的标记能力，其（8 eq.）能在5min内实现对DupA近乎完全的标记。

然而，作者随后发现探针5并非与DupA的预期残基反应：探针在His67和His169双突变体上仍能实现标记。为了解释这种现象，作者解析了5-DupA共价加合物的晶体结构，结果清晰地解释了5的实际反应位点，即与催化中心临近的Cys196残基。吻合地，在突变Cys196或用碘乙酰胺处理后，5丧失了标记能力。

最后，作者尝试在受嗜肺军团菌侵染的HEK293T细胞裂解物中使用共价探针全局捕获Dup效应酶。以同样带有富集把手的泛素作为对照，共价探针9可特异、显著地富集到已知的效应酶DupA和B，但并未鉴定到新的Dup酶。一些经典泛素化途径中的组分可被探针较弱地富集，作者猜测它们可能和带有磷酸核糖泛素化修饰的底物相互作用。