为大家分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Validation of a New Methodology to Create Oral Drugs beyond the Rule of 5 for Intracellular Tough Targets。本文通讯作者来自日本制药企业中外制药株式会社（Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.）。
针对细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）建立临床药物的研发技术平台具有重要的商业前景。对于上述场景，相比于主流的小分子和抗体，中等尺寸环肽能够更好地适用于细胞内以及缺乏小分子结合深腔的靶点。然而，目前除了Lipinski五规则（rule of five），针对中等尺寸环肽尚缺乏关于其成药性的系统性认识。因此，目前筛选得到的多肽类先导化合物往往成药性较差，续进行漫长的改性优化，因而面临活性丧失的风险。本文通过阐明类药物环肽的结构特征和理化性质，获得了关于环肽成药性的系统认识，最终针对细胞内强韧靶点，创造出强效的口服药物。
图1 多肽类先导化合物的结构优化
首先，本文参考已上市药物cyclosporine的结构特征，设计并合成的环肽文库（图2）。上述环肽由N端伯胺与C端Asp残基侧链羧基之间形成异肽键而成，文库整体满足如下多样性分布：氨基酸残基8−12个、N-烷基化0−8个、Clog P为4.4-15.2、羟基0或1个、分子量为845-1499 g/mol。
图2 环肽文库构建
本文将“成药性”定义为可接受的膜渗透性和代谢稳定性。初步评估表明，含11个残基的环肽满足成药性标准的比例最高。进一步，作者发现Clog P大于12.9、N-烷基化多于6个对于成药性具有显著贡献（图3）。对于极性与带电基团，结果表明3个羟基或一个带电基团的存在，就会极大地影响环肽的膜渗透性。最终，作者证实上述筛选得到的类药环肽确实具有较好的口服生物可及性和体内分布，证实了上述结论的可靠性。
图3 不同结构环肽的成药性
认识到具有优异成药性的环肽文库与已有的环肽建库方法之间存在较大差异，作者进而寻求建立具有良好成药性的体外翻译体系（in vitro translation, IVT）。第一个挑战，是实现N-烷基化氨基酸的连续插入。作者基于pCpA方法，通过对每个氨酰tRNA合成酶进行突变，将N-烷基化氨基酸的连续插入效率提高至80 %以上。第二个挑战，是代谢稳定的成环策略。作者采用还原脱除的正交保护基以及类似于天然化学偶联（native chemical ligation）的成环反应，顺利解决了上述问题。利用上述IVT体系，作者建立了具有良好成药性的mRNA展示文库，并以KRAS为模型蛋白进行筛选。所得环肽与KRAS的亲和力为0.3-2.9 μM，其中，先导化合物AP8784，对KRAS与SOS1之间的PPI表现出良好的抑制效果，IC50为180 nM（图4）。
图4 先导化合物AP8784
在不改变骨架的基础下，作者对AP8784进行了一些结构优化，得到了活性更优的化合物LUNA18（图5）。LUNA18对各种KRAS突变体均具有超强的亲和力，KD最低可达31 pM。对于多种KRAS-G12X突变的癌细胞系，LUNA18亦表现出nM的抑制效果。
图5 结构优化的化合物LUNA18
综上所述，本文通过文库分析，对环肽成药性获得了系统的认识，并建立了具有较高成药性环肽的mRNA展示技术，最终针对细胞内靶点KRAS，创造出强效的口服药物。原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.3c07145文章引用：DOI：10.1021/jacs.3c07145
