on style="white-space: normal">美国加州大学洛杉矶分校唐奕教授课题组和中国科学院深圳先进研究院周佳海研究员课题组通过基因组挖掘和异源表达，首次阐明了Trichoderma afroharzianum t-22 中哈茨酸 (harzianic acid, HA) 的生物合成途径，并发现乙酰乳酸合成酶 (acetohydroxyacid synthase , AHAS)是HA的作用靶点。通过体内和体外测试HA对不同生物AHASs的抑制效果，发现该化合物可以抑制野生型和对商业除草剂具有抗性的AHAS突变体。此外，还发现植物和酵母来源的AHAS对HA相对不敏感，HA更倾向于选择性地抑制丝状真菌的AHAS。通过解析真菌来源的ThAHAS与HA 的复合物晶体结构，观察到HA与商业除草剂具有截然不同的结合模式。该研究不仅为新型除草剂的开发提供了理论基础，同时也为通过优化HA的化学结构创制植物耐药病原真菌的杀菌剂提供了可能途径。该工作于6月16日在线发表在J. Am. Chem. Soc.上，同时被JACS 选为spotlight焦点话题。
由微生物合成的天然产物被广泛应用于医药领域，同时在农业领域也发挥着重要作用。 例如，土壤微生物分泌的一些小分子化合物脱落酸(abscisic acid)和赤霉素 (gibberellin)等可抑制植物病原菌，促进植物生长。对这些天然产物生物合成途径及活性的深入研究，有助于开发新型除草剂和抑真菌剂。被广泛应用于生物防治的Trichoderma afroharzianum t-22 (Tht22) 在影响土壤微生物组成、植物养分吸收和发育等方面发挥着重要作用。哈茨酸 (harzianic acid, HA) 是从Tht22中分离得到的一种新型的铁载体，可促进植物的生长和对铁离子的吸收利用，同时对多种植物病原真菌具有抑制作用。通过对Tht22基因组的生物信息学分析，发现了参与HA 生物合成的基因簇（图1A）：含有PKS-NRPS (hacA)、反式烯基还原酶 (hacB)、氨基转移酶 (hacD)、N-甲基转移酶 (hacE)和2个醛缩酶 (hacC1和hacC2)的编码基因，并且在基因簇中还发现了一个截短的乙酰乳酸合成酶AHAS 基因 (hacH)。进一步的分析表明，在Aspergillus ibericus 和Penicillium digitatum 及部分Trichoderma 中也发现了同源基因簇 (BGCs)。值得注意的是在其他同源BGCs中均含有一个完整的AHAS 编码基因 (AHASM)。通过在构巢曲霉体系中的异源表达，确定了HA的生物合成途径(图1B和1C)：起始的非天然氨基酸单元4-hydroxy-4-isopropyl glutamate (L-HIG)由HacC2 催化丙酮酸及α-异丙酮酸通过醛醇缩合生成 S-4-hydroxy-4-isopropyl-2-oxoglutarate (HIOG)，并经HacD2的转氨作用后合成，经HacA的NRPS模块激活识别后与HRPKS模块合成的二烯酮聚酮缩合为{attr}3120{/attr}化的聚酮-非核糖体肽杂合分子，经Dieckmann环化反应得到tetramic acid 类似物demethylharzianic acid (5), 最后由N-甲基转移酶HacE甲基化得到终产物 HA (1)。
Figure 1. Proposed biosynthetic pathway of HA.
乙酰乳酸合成酶 (AHAS)是催化侧链氨基酸生物合成途径第一步反应的酶，是目前常见除草剂和杀菌剂的作用靶点之一。在Tht22 BGC中，AHAST(hacH)结构缺失，被证实不参与HA的生物合成，但在A. ibericus 和P. digitatum的同源BGCs 中均含有完整结构的AHAS (分别为AiAHASM和 PdAHASM)，并且在各自基因组中均含有另一高度同源的housekeeping AHAS(AiAHAS和 PdAHAS)。有趣的是在Tht22 基因组中发现了两个完整AHAS，分别为ThAHASM 与ThAHAS，蛋白序列比对发现AHASM同源蛋白在与除草剂抗性有关的活性位点脯氨酸(P)均发生了突变，ThAHASM, AiAHASM和PdAHASM 相对应的位点分别突变为缬氨酸(V), 缬氨酸(V)和丙氨酸(A), 而AHAS的对应位点未发生变化 (图2A)。为测试AHAS是否为HA的作用靶点，AHASM能否起到自抗(self-resistance)作用，通过纯化AtAHAS (Arabidopsis thalianaAHAS )、SceAHAS (Saccharomyces cerevisiae AHAS )、ThAHAS 及ThAHASM进行体外抑制试验, 并结合对一系列Δilv2:: AHAS酵母回补菌株的生长抑制试验，发现植物和酵母来源的AHAS对HA相对不敏感，但HA可以选择性地抑制真菌来源的野生型AHAS和对商业化除草剂具有抗性的AHASM (图2B 和 2C)。
Figure 2. AHASM is resistant to commercial herbicides.
作者进一步解析了ThAHAS与HA 复合物的高分辨率晶体结构(图3A)，与已知的商业化除草剂磺草唑胺(MT)和Candida albicans CalAHAS的复合物晶体结构相比，ThAHAS-HA和CalAHAS-MT活性位点的大部分残基构象几乎相同，但W587的侧链方向存在显著差异。在CalAHAS-MT复合体中，W587的吲哚环旋转90°与 MT的三唑嘧啶环中存在π system(图3D), 因此，MT在底物隧道中埋得更深。P188诱导多肽链的卷曲，使A191与MT甲基发生疏水性的相互作用，同时也与MT形成CH–π 相互作用。而在ThAHAS-HA复合体中，HA与P188和A191口袋之间缺乏接触 (图3C)，这合理地解释了HA 可以抑制具有除草剂抗性的AHASM的原因。此外，通过建模发现植物和真菌来源的AHASs在A251和Y592区域的残基存在显著差异。丝状真菌(和酵母)中保守的A251对应于植物AtAHAS中的Q260，而非互作残基P116对应于AtAHAS中的E125(图3E)。在AtAHAS中这些残基较大的侧链使底物入口通道明显变窄。这种收缩导致HA的C6’亚甲基和C7’羟基发生空间碰撞(图3E)，从而阻止HA与AtAHAS结合。作者还发现A658 Cβ原子与HA C2’ 羰基氧原子之间的距离为3.6 Å, 而SceAHAS中相应的残基G653位于5.3 Å之外，这可能是导致HA 选择性地抑制丝状真菌来源的AHAS的原因。接下来，通过比对常见的植物病原真菌的AHASs蛋白序列，发现这些植物病原真菌的AHAS对应的P188残基均发生了抗除草剂突变。作者分别纯化了F.oxysporium (FuoAHAS) 和 S. sclerotiorum (ScsAHAS) 蛋白，其活性在体外反应条件下均能被HA抑制，但对除草剂sulfometuron methyl (SM)具有抗性。最后，在抗真菌活性试验中，在缺失侧链氨基酸(Leu, Ile, and Val)的培养基中，HA可有效抑制F.oxysporium菌体的生长，说明HA 能以AHAS作为靶点通过抑制侧链氨基酸的合成途径从而达到抑制植物病原真菌的效果，研究结果为HA在防治植物病原真菌中发挥的作用提供了新的思考。
Figure 3. Crystal structure of ThAHAS-HA complex.
Figure 5. HA inhibits phytopathogenic fungi growth.
综上所述， 本文作者确定并重建了HA的生物合成途径，并通过一系列的生化分析证明了HA是一种可以抑制包括对商业化除草剂产生抗性在内的真菌来源AHAS的选择性抑制剂。ThAHAS与HA 的复合物晶体结构解析揭示HA与已知的商业化除草剂结合模式相比存在明显差异，该结果为开发更有效的新型除草剂和抑真菌剂提供了结构和理论基础。中国农业科学院生物技术研究所博士生谢李楠和中国科学院上海有机化学研究所博士生臧鑫为该文的共同第一作者，加州大学洛杉矶分校（UCLA）的唐奕教授、博士后陈梦玢和中国科学院深圳先进研究院周佳海研究员为该文的通讯作者。本工作感谢上海同步辐射光源（SSRF）BL17U1线站和上海蛋白质设施BL19U1线站老师的支持与帮助。
