中国科学院青岛生物能源与过程研究所丛志奇研究员课题组，将 P450 酶的半理性设计和双功能小分子（dual-functional small molecule, DFSM）协同 P450 催化策略有机结合实现苯乙烯及其衍生物的立体选择性环氧化，(R)-氧化苯乙烯的对映选择性达 99% ee，最优突变体（98% ee）的催化转化数(TON)高达 4350，为目前 P450 酶催化苯乙烯环氧化的最优性能。氯/氟代氧化苯乙烯的(R)-对映选择性均实现 95% ee-99% ee。典型突变酶的半制备量反应保持了高度(R)-对映选择性，产物分离收率达到 43%。该研究结果近日发表在英国皇家化学会旗舰期刊 Chemical Science 上，并被选为封面文章（Back Cover），第一作者为中国科学院青岛生物能源与过程研究所赵盼霞和博士后陈杰。

光学纯度的氧化苯乙烯是医药、手性化学品和功能高分子的重要合成砌块，烯烃的不对称环氧化是合成该化合物最经济、简洁的方法之一。尽管苯乙烯不对称环氧化已取得重要进展，然而包括化学和生物催化在内的大多数体系均以(S)-构型手性产物为主。开发高度(R)-对映选择性苯乙烯环氧化的工程酶仍具有一定挑战和重要价值。

细胞色素 P450 单加氧酶是公认的多功能生物氧化催化剂，是众多天然产物生源合成途径中的限速酶之一，能催化多种不同类型的烯烃环氧化反应，然而已报道的野生型 P450 及其工程酶在苯乙烯环氧化的(R)-对映选择性控制方面均不理想。另外，绝大多数 P450 单加氧酶催化功能的实现高度依赖提供还原力的辅酶 NAD(P)H 和负责电子传递的还原伴侣蛋白。鉴于 P450 酶在合成生物技术领域的巨大潜力，丛志奇研究组近年来致力于开发不依赖于还原辅酶的非天然 P450 过加氧酶催化系统，在国际上首次提出“双功能小分子协同 P450 酶催化”的新概念，通过引入带有内嵌碱性基团的外源小分子作为助催化位点，协助 P450 的血红素活性中心活化过氧化氢，成功将单加氧酶 P450BM3 改造为以过氧化氢作为末端氧化剂的 P450 过加氧酶 (Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 7628, selected as Very Important Paper and Frontispiece; Chem. Eur. J. 2019, 6853, Invited Concept, selected as Review Showcase and Frontispiece; ACS Catal. 2019, 7350; Catal. Sci. Technol. 2020, 1219, selected as Inside Front Cover)。双功能小分子 N-(ω-咪唑基)-己酰基-L-苯丙氨酸衍生物（N-(ω-imidazolyl)-hexanoyl-L-phenylalanine, Im-C6-Phe）在发挥助催化作用的同时也可调节底物的结合构象，进而影响反应的区域和立体选择性。苯乙烯环氧化研究发现，双功能小分子 Im-C6-Phe 的化学干预作用可使 P450BM3-F87A 催化苯乙烯环氧化 R 构型的对映选择性从 8% ee 提高至 84% ee（图 1）。基于此，本研究利用 P450 酶的半理性设计和双功能小分子协同 P450 催化策略有机结合来进一步提升苯乙烯环氧化 R构型的对映选择性。

1、T268 突变对活性和对映选择性作用研究

与天然 P450 酶相比，“双功能小分子协同的人工 P450 过加氧酶”具有独特的催化特征：解除了 P450BM3 酶工程改造中对高度保守位点 T268 的突变限制，T268 位于血红素活性中心的最近端，是天然酶中诱导催化活性中间体形成的关键残基，同时其对底物结合构象有明显调节作用（图 2A），T268 的可突变为催化反应的区域和立体选择性控制提供了更多的可能。

于是首先对 T268 位点与双功能分子 Im-C6-Phe 的协同作用进行研究。NAD(P)H 体系下，不添加 Im-C6-Phe 的对照组，F87 单突变 F87A/G/V 催化苯乙烯环氧化的对映选择性较差（表 1、1-3行）；引入 T268V 突变，双突变 F87A/T268V、F87G/T268V、F87V/T268V 的活性大幅下降，因此在 NAD(P)H 体系下难以通过 T268 突变来调节苯乙烯环氧化的对映选择性。在 H₂O₂ 体系下，不添加 Im-C6-Phe 的对照组，F87A/T268V、F87G/T268V、F87V/T268V 均无活性；添加 Im-C6-Phe，苯乙烯环氧化的活性得到大幅提升（表 1、10-12 行），充分表明 DFSM 可作为酸碱催化剂来协助活化利用 H₂O₂，进而解除高度保守位点 T268 的限制。此外 T268V 的叠加突变可提升(R)-氧化苯乙烯的对映选择性（表 1、10-12 行）。因此在双功能小分子协同的 P450BM3-H₂O₂ 体系下，通过 T268 突变与其他位点的组合突变可进一步提升苯乙烯环氧化的催化活性和 R构型对映选择性。

2、蛋白质工程提升(R)-氧化苯乙烯活性及对映选择性

在上述基础之上，对 F87/T268 双突变体进行半理性设计（F87A/T268V、F87A/T268I、F87G/T268V、F87G/T268I、F87V/T268I 和 F87I/T268I），(R)-氧化苯乙烯的对映选择性得到进一步提升（83% ee-97% ee）。选取对映选择性最优双突变 F87A/T268I 为亲本酶进行底物空腔周围其他关键位点（图 3A）的叠加突变，其中 F87A/T268I/L181Q 将(R)-氧化苯乙烯的对映选择性提升至 99% ee（图 3B），30 min TON 为 918。将筛选得到的有益突变进行组合，进一步获得 F87A/T268I/V78A/A184L 将 TON 提升至 4000 以上，(R)-氧化苯乙烯对映选择性依然保持 98% ee。

3、底物谱范围

将本研究策略体系拓展至苯乙烯衍生物的环氧化，其同样具有优异的不对称催化性能。（R）-氯代氧化苯乙烯的对映选择性均可实现 95% ee-99% ee（图 4），（R）-氟代氧化苯乙烯的对映选择性亦达 97% ee-99% ee（图 4）。268 位氨基酸侧链的大小对具有较大 Cl 取代基的底物的对映选择性和催化活性有明显影响。

4、(R)-氧化苯乙烯的半制备量反应

对获得的典型突变 F87A/T268I/L181Q 和 F87A/T268I/V78A/A82V 进行苯乙烯环氧化的半制备量反应。其(R)-氧化苯乙烯的对映选择性可保持不变，分离产率分别达到 43.8% 和 54.2%（表 2），底物苯乙烯的挥发损失造成分离产率有所降低。

本研究利用 P450 酶的半理性设计和双功能小分子协同 P450 催化策略的有机结合，通过对 T268 位点的系统研究及与 F87 的组合突变，并结合底物空腔周围位点的迭代突变实现了苯乙烯不对称环氧化对映选择性的高效控制，(R)-氧化苯乙烯的对映选择性可达 99% ee，取代苯乙烯的对映选择性亦均实现 95% ee-99% ee。典型突变的半制备量反应可保持(R)-氧化苯乙烯的高度对映选择性。T268 突变的关键作用协同 DFSM 的化学干预为对映选择性控制提供了一条高效策略，而该策略在 NAD(P)H 体系无法实现。本研究显示了蛋白质工程与双功能小分子协同 P450 过加氧酶催化策略结合在烯烃不对称环氧化方面的独特优势，拓展了 P450 酶的催化应用范围。

• Enabling highly (R)-enantioselective epoxidation of styrene by engineering unique non-natural P450 peroxygenases. 
  Panxia Zhao#, Jie Chen#, Nana Ma, Jingfei Chen, Xiangquan Qin, Chuanfei Liu, Fuquan Yao, Lishan Yao, Longyi Jin and Zhiqi Cong*(丛志奇，中科院青能所)
  Chem. Sci., 2021, 12, 6307-6314.
  http://doi.org/10.1039/D1SC00317H

  

  
  

陈杰 博士后

中国科学院青岛生物能源与过程研究所

2009 年毕业于中国海洋大学，分别于 2013 和 2020 年取得中国科学院大学硕士和博士学位，2020 年 11月至今，在中国科学院青岛生物能源与过程研究所从事博士后研究，从事细胞色素 P450 酶的分子设计与催化应用，以第一作者在  Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、Chem. Sci. 等期刊发表文章 4 篇。曾获得中科院院长奖、朱李月华优秀博士奖、国家奖学金、中国科学院大学优秀毕业生等多项荣誉奖项。

丛志奇 研究员 博导

中国科学院青岛生物能源与过程研究所

2009 年在日本熊本大学获得理学博士学位，曾先后在日本分子科学研究所和名古屋大学从事金属酶化学机制与催化研究。2016 年加入现单位担任单碳酶催化研究组组长，主要研究方向为酶化学生物学与合成生物学、酶工程、生物催化与生物转化，以第一作者和通讯作者在 J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、Chem. Sci. 等国际期刊发表论文 20 余篇，相关成果被 ChemistryViews 等科学媒体作为亮点报道。